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超声波破碎细胞的常见问题有哪些

       大肠杆菌表达外源蛋白,在超声破碎的时候,用含有1%triton-X-100的PBS悬浮,然后超声的效果较好,1%triton-X-100的作用还是很明显的,对其他的一些细菌同样起作用,比如链霉菌。
      细菌沉淀直接加样品1buffer,再加5ul的巯基乙醇,混匀,离心,煮沸10min,直接上样,染色脱色步骤如下:将胶放入适量的染色液微波炉里加热1min(下次适当补点醋酸即可),将染色液换成大量的水(自来水即可)在微波炉煮10min就可以。 
      在表达重组蛋白后超声波破碎细胞,采用冰浴,400w,破2s停1s,但是不一会就产生大量泡沫,影响了破碎功率,pbs和tris缓冲液都是这样,zui后都是破碎不完全,而我的目的蛋白就在这些未破碎的细胞中。

1.会产生气泡是因为你的探头位置没放好。探头一定要接近底部,约1cm(我一般是距底部0.5mm)。功率根据仪器不同会有所不同,但你可以观察液面,有波动但不要太剧烈就好。

2.破3S停10S,破个二三十次看看。

3.变幅杆位置摆放也要注意,听声音如果不对的话就要及时调整。另外可以从菌浓度方面考虑。在破碎时试着加大体积,强度不要超过60%.

4.尝试超8s停8s,对有些菌体蛋白来说,你的方法很难散热,导致蛋白变性产生气泡,停顿时间稍长一些,这种情况多见于包涵体形式的蛋白。

链霉菌(放线菌)超声破碎的,用的方法条件是什么?

前处理一般就是配置成一定浓度的菌悬液。
 
使用超声破碎时采用的具体条件是:
(1)取细菌的24h培养液于5000r/min下离心5min收集菌体.
(2)用pH7.5的Na2HPO-NaH2PO缓冲液洗涤3次,再用该缓冲液将菌体配成1:3的菌悬液.置于40mL大塑料试管内.
(3)将大塑料试管置于冰浴中,采用超声波破碎(功率200W,1/2”探头,破碎30s,间歇30S).
(4)破碎液于12000r/min下高速冷冻离心30min,收集细胞碎片和上清夜.

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