分光光度计利用有色溶液对某一波长光的吸收，从而求得被测物质含量。单色光只含一种波长的光。单色光射入有色溶液，被有色溶液吸收一部分，所以通过溶液后其强度减弱了。光线减弱的程度（lgI0/It）与溶液浓度及光线经过的液层厚度有下列关系：
A=lgI0/It=KcL；式中的A为吸光度；K为比例常数；L为有色溶液的厚度；c有色溶液的浓度；I0为入射光的强度；It为通过溶液后（透射光）光的强度。
如果光线通过溶液*不被吸收，则I0=It，这时lgI0/It=0；光线吸收得越多，则lgI0/It的数值就越大。因此这一项是表示光线通过溶液时被吸收的程度，通常叫“光密度”或“吸光度”，用符号A表示，由上述关系式得知，溶液的光密度与溶液中有色物质的浓度和液层厚度的乘积成正比。当液层厚度一定时，测定有色溶液的光密度，就可以得出它的浓度。
分光光度计是利用光学原理，将白光通过光栅（或棱镜）、反光镜、透镜、狭缝而获得单色光。单色光通过有色溶液作用于光电池，光电池受光照产生电流，电流强弱与照射光的强弱成正比，这样光电流的大小反映了有色溶液吸收光的程度，也就是光密度的大小。光密度的值可以从仪器上读取。
用分光光度计测定溶液浓度，首先要作工作曲线，即先配制一系列不同浓度的标准溶液，测其光密度，然后以光密度为纵坐标，以浓度为横坐标，在标准坐标纸上绘制标准曲线，此线是通过原点的直线。然后再测未知试样有色溶液的光密度值，由测得的光密度值便可在标准曲线上得到未知溶液对应的浓度。
分光光度计测铁含量的试验步骤：
1.用移液管分为准确移取铁标准液0.0ml，0.5ml，1.0ml，1.5ml，并依次注入1#，2#，3#，4#四只50ml的容量瓶中。
2.用另一只移液管准确移取待测铁试液1ml置于5#50ml容量瓶中。
3.分别用量筒量取10%NH4Ac溶液5ml，2%抗坏血酸溶液5ml加入到1#-5#容量瓶中，然后把5只容量瓶同时置于沸水浴中加热30s（注意切勿盖塞子），立即向各容量瓶中加入0.1%邻菲罗啉10ml，冷却，用蒸馏水稀释至刻度，摇匀。
4.用比色皿分别盛装1#容量瓶中的空白液，和2#，3#，4#，5#容量瓶中的铁标准液和待测铁试剂，置于分光光度计的框架上测定相应的光密度值，并记录。
5.绘制标准曲线。在坐标纸上，以铁标准溶液的光密度值为纵坐标，已知溶液的含铁量（μg·ml-1）为横坐标，绘制标准曲线。
6.根据待测铁试液的光密度值，在标准曲线上查出其对应的铁含量M（μg·ml-1）。
7.计算铁的含量：ωFe(%)=M×10-6×250×50×100%÷0.05。
